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第三章 枸杞功能基因组学研究（第1页）

现状及研究前景

全基因组测序是进行功能基因组学和遗传学研究的重要信息基础，是深入解析物种内在功能基因和调控元件的必要前提。利用全基因组测序极大地推进人类对物种系统进化、物种群体遗传结构等方面认识，为更好地保护和利用植物资源提供强大技术支撑。目前陆地植物约有39。1万种，绿藻约有8000种，庞大植物资源其基因组大小为10Mb~100Gb。在植物漫长的进化中使其在大规模灭绝事件中存活下来，多倍体化是一个频繁发生的事件，并产生了大量多倍体基因组。自从2000年首个模式植物拟南芥基因组被破译以来，全球陆续已经释放了超过1000个植物基因组的序列，覆盖了788个物种，其中，双子叶植物572种、单子叶植物110种、裸子植物13种、蕨类植物3种、石松植物4种、苔藓植物12种、轮藻纲植物7种，绿藻纲植物54种；十字花科已完成83个种的参考基因组。已发表的植物基因组大小跨度较大，中位数为575。5Mb，最大的31Gb。

2006年，第一个木本植物毛果杨全基因组序列公布，标志着木本植物基因组时代正式开启。随着测序技术和生物信息技术快速发展，一批高杂合、倍性复杂以及较大基因组的木本植物基因组组装陆续完成，木本植物基因组组装研究正如雨后春笋般涌现。全球木本类树木约有73000种，目前已完成基因组有350多个树种，杨柳科、蔷薇科、芸香科物种相对占比较高。我国茄科类植物有25属，约115种，其中枸杞为茄科类多年生木本植物，与番茄、马铃薯、辣椒、茄子和烟草都是世界上重要的经济作物。目前完成基因组测序的茄科物种聚集在蔬菜类植物，如烟草、番茄、辣椒、马铃薯和茄子等草本植物，而木本植物的基因组报道相对较少。木本植物基因组研究，为林木类植物进化、经济性状的遗传解析和功能基因学研究奠定重要的基础，加快推动林木分子育种和遗传改良的进程。

第一节枸杞基因组学研究

一、枸杞叶绿体基因组研究

叶绿体是绿色植物和真核藻类特有的细胞器，是光合作用以及许多其他重要生物学过程发生的场所。高等植物叶绿体基因按照其功能可大致可分成4类，即光合作用有关基因、叶绿体基因组转录翻译表达相关基因、其他生物合成相关基因和功能未知基因。通过二代测序，Yisilam等首次组装了黑果枸杞（Lyciumruthenicum）的叶绿体基因组，该基因组长度为154996bp，包含了2个单拷贝区域，2个反向重复区，GC含量为37。9%，共预测到111个基因，编码了30个tRNA基因、4个rRNA基因和77个蛋白基因。2019年Yang等完成了中国枸杞（LyciumchinenseMill。）的叶绿体基因组，组装的长度155756bp，GC含量与黑果枸杞叶绿体类似，为37。8%。大的单拷贝区域为86595bp，小的单拷贝区域为18209bp；同样包含了2个方向重复序列，总长25476bp。该基因组编码114个基因，85个编码蛋白的基因。枸杞叶绿体基因组密码的破解加速了对茄科物种的系统进化认识。

二、枸杞基因组研究

2021年6月3日，宁夏农林科学院曹有龙研究员团队与国内外10家科研单位合作，在Nature子刊CommunicationsBiology期刊上公布枸杞全基因组序列，在国际上首次利用单体植株，组装出了染色体级的高质量枸杞基因组，将“枸杞”以汉字形式在英文期刊中首次出现，利用枸杞全基因组数据库，宁夏枸杞和黑果枸杞中分别注释到了33581和32711个蛋白质编码基因，解决枸杞传统分类中长期没有搞清的分类与起源进化难题；绘制出长期没解析清楚的遗传图谱，精准定位到产量、果实大小、功效物含量等性状遗传位点；挖掘出枸杞黄酮、亚精胺、甜菜碱、花青素、类胡萝卜素合成等关键基因基因簇；阐明了枸杞黄酮合成、类胡萝卜素代谢及亚精胺合成调控机制，揭示出枸杞果实大小及品质相关性状的遗传机理，阐明了黄酮、类胡萝卜素及亚精胺等类功效物质代谢调控网络，挖掘出一大批枸杞关键标记和功能基因，填补了目前在枸杞优异性状功能基因组学和基础遗传方面空白。该成果获得2021年宁夏回族自治区科技进步奖一等奖。

第二节枸杞功能基因组学研究

功能基因组学是结构基因组完成基础上，基于基因组序列信息，利用组学技术及分子生物学技术，将基因组序列与基因功能以及表型有机联系起来，最终揭示自然界中生物系统不同水平的功能。从遗传学角度来讲，与表型相关的基因序列信息可以来自正向遗传学，通常利用表型鉴定出决定表型的基因；通过一定的手段确定基因决定的表型，即改变某个特定的基因鉴定或发现表型变化为反向遗传学研究。简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。无论正向遗传学还是反向遗传学都是进行高效生物育种设计的必要条件。尤其正向遗传学快速发展已被广泛用于剖析林木类植物的生长、发育、产量、抗性和适应性等性状，推进了多年生木本植物的分子育种的发展。

一、枸杞重要农艺性状遗传定位研究在现代分子育种研究中，遗传标记的开发已成为基因定位和辅助选择的关键环节。随着测序技术的发展，使得分子标记技术的开发走向商业化、实用化和便捷化。利用开发出的SCAR标记，鉴定出中国枸杞区分其他枸杞种；通过16种枸杞材料，开发出ISSR标记，分析了不同枸杞遗传多样性；利用RAD-seq开发大量SNP标记，基于SNP标记发现地方品种都与宁夏枸杞存在共同祖先；通过转录组测序从38922个unigene中鉴定出50093个EST-SSR，该标记可用于遗传多样性评估。曹有龙课题组首次利用SSR和AFLP标记构建了总长度为557。6cm枸杞遗传连锁图谱，平均距离为3。38cm；随后，利用基因组测序开发出标记，建立了总长为964。03cm的枸杞高密度遗传图谱，并定位到枸杞光合性状和树干直径的QTL位点；同时又利用简化基因组测序技术，开发出6733个SNP标记，构建总图距为1702。45cm，平均图距为0。253cm枸杞高密度遗传图谱，定位到了55个与果实和叶片相关稳定QTL位点；同样采用简化基因组技术开发出3495个标记，建成总图距1649。03cm平均图距0。47cm遗传图谱，并检测到117个QTL。2021年曹有龙课题组采用重测序技术，开发了8507个高质量SNP，并整合前期获得开发出标记，构建12条染色体上涵盖1524个标记高密遗传图谱，总图距为3058。19cm，平均图距为0。21cm，结合转录组数据分析，发现了82个基因与果实性状紧密连锁。

二、枸杞重要性状基因功能研究

枸杞中分离出乙烯反应转录因子LchERF，在烟草中LchERF过表达提升了种子萌发和营养生长期的耐盐性；从枸杞中分离出LcMKK，可通过激活细胞抗氧化防御系统或激发多种基因的转录水平来调节ROS稳态，从而在脱水干旱应激反应中发挥调节作用；从中国枸杞叶中分离出类胡萝卜素裂解双加氧酶基因（LcCCD4），并发现该基因可能参与枸杞叶和花中产生芳香族类胡萝卜素积累。此外，还发现LcPDS、LcZDS和LcRTISO在枸杞中具有提高类胡萝卜素含量和耐盐性的潜力。利用全基因组技术，发现枸杞LbaR2R3-MYB基因分为31个亚组，并鉴定到Lba11g0183和Lba02g01219是调节枸杞类胡萝卜素生物合成的关键候选基因；同样还发现了LbaBBX2和LbaBBX4可能在玉米黄质和花药花素生物合成的调控中起关键作用。基于转录组数据，从枸杞中分离出MYB转录因子的LrAN2和LbAN2，两基因存在2个氨基酸差异，LrAN2和LbAN2的过表达诱导了烟草所有组织中的花青素生物合成，且前者转基因植株叶片中的花青素含量高于后者。此外，发现枸杞中LbAMT3-1的过表达促进宿主植物对磷和氮的吸收，增加定植强度和丛枝丰度；脱落酸可以激活枸杞LrMYB1诱导盐胁迫下的花青素生物合成。

三、枸杞果实代谢物相关基因功能研究在过去了几十年，代谢组学研究取得了巨大进展，研究者已经提出了各种代谢组分析方案，建立了可靠的样品制备和质谱分析计算方法，尤其计算机学科融入使得高精度大规模代谢物数据提取迈开了关键一步。据估计，植物界的物种总共合成了106种代谢物。研究者也对分离注释到植物代谢物有着深刻的了解，但其结构变化复杂性仍然对代谢物的分离和注释具有挑战性。2018年，曹有龙团队与海南大学罗杰教授合作，建成种类和数量最多枸杞代谢物数据库（1032种）。近年来，枸杞代谢组学研究刚刚起步。利用HPLC方法检测到枸杞成熟果中主要以葡萄糖和果糖积累为主，柠檬酸和酒石酸是积累的主要有机酸。随后，利用UPLC-ELSD分析方法实现枸杞果实甜度快速检测，采用NMR、LC-MSMS和GC-FIDMS联合方法，检测到枸杞中90多种代谢产物，包括糖、氨基酸、脂肪酸、胆碱等代谢产物，其中一些代谢物存在显著差异；在黑果枸杞中高水平积累飞燕草色素衍生的花青素，而宁夏枸杞果实高水平积累类胡萝卜素，且发现果实中花青素生物合成差异与F35HF3H基因的转录相关；在黑果枸杞中的LbCCD4基因高表达造成果实胡萝卜素持续降解，最终导致黑果枸杞中无法检测到类胡萝卜素。课题组利用307份枸杞种质资源基因组学和代谢组学研究，挖掘出控制枸杞类黄酮、花青素和生物碱等活性合成关键转录因子，并解析这些物质形成的调控网络。

第三节枸杞功能基因组学研究前景一、枸杞泛基因组学研究前景

2005年由Tettelin等提出泛基因组的概念以来，几十年来，水稻、玉米、小麦、大豆、棉花、高粱、番茄等十余种植物中的泛基因组被完成。正是由于遗传物质的交换、重组和变异缘故，物种个体都可能有其独特的遗传信息，所以单一参考基因组无法代表一个物种的遗传多样性。借助泛基因组，可以鉴定到单一基因组无法捕捉到的基因位点，随着基因测序技术的技术快速发展，泛基因组已突破传统单个参考基因组的局限性，加深对物种基因组进化、驯化和功能等方面的了解。目前，泛基因组已被广泛应用到遗传学和育种学中，其中基于T-2-T基因组骨架的图形泛基因组，可能是未来进行遗传育种研究的理想选择之一。图形化泛基因组已被证明在番茄中可以挽救部分“消失的遗传力”，作为参考序列已发挥出巨大的潜力。植物进化过程中通常伴随有多轮的基因组复制及分离现象，基因串联复制、转座、缺失、重排和跨群体重组时常会引起植物基因组变异，这些变异与表型多样性、环境适应性和选择驯化或遗传改良密切相关。利用泛基因组开发出存在缺失变异（PAV）和结构变异（SV）可以提高挖掘控制作物农艺性状的关键基因。例如，西红柿驯化过程中与风味相关的基因丢失，利用泛基因组研究在小麦、甘蓝型油菜和番茄等植物中都观察到了抗病基因PAV。此外，泛基因组在植物进化机制认识方面发挥重要作用，如在草莓和油菜亚基因组之间观察到显性亚基因组承载着更大比例的核心基因；芸薹属植物经历了一个全基因组三倍化事件后的分化，产生了3个亚基因组；大约在7000万年前芝麻经历了基因组多倍化（WGD）。总之，泛基因组在提高作物育种效率方面具有巨大的潜力。随着基因测序技术快速发展，泛基因组学解决了复杂植物基因组所带来的挑战，有助于更多的野生资源优良基因被发现并应用到育种中，支撑了分子设计育种的快速发展。

相比模式植物而言，枸杞的基因组学研究较为滞后，一方面枸杞的基因组较大，另一方面枸杞属于高杂合的多年生木本植物。宁夏农林科学院曹有龙团队利用单体枸杞解决了高度杂合的问题，组装出染色体水平枸杞全基因组，建成第一个基因组数据库。该数据库为枸杞基础研究和应用研究提供可靠数据信息，同时为进一步开发分子标记、挖掘重要功能基因和解析生长发育机制等分子生物学研究提供重要基础和依据，为枸杞提供更强大的育种指导系统。

单倍体的参考基因组尽管使得基因组分析变得简单化，但是不能真正反映个体的基因组组成。目前大多数高度杂合的二倍体或者多倍体物种的基因组为嵌合基因组，忽略了单倍型之间的大量的重复序列、SNP和结构变异。这时，单倍型的精确组装和定相非常重要，因为等位基因的特异性分析对杂种优势解析和基因克隆至关重要。目前，多倍体和高杂合度的植物基因组组装仍是一个挑战，随着测序成本和技术进一步优化，以高通量测序技术为基础的各种组学研究广泛应用于木本植物的结构基因组和功能基因组学领域。组装出高质量的参考基因组，可以加快枸杞功能基因组学的深入。

二、枸杞功能基因组学研究前景

枸杞是我国重要药食两用植物资源。目前药用植物功能基因组学研究重点集中在活性成分、生长发育调控和抗胁迫耐受性等领域研究，以此来提高药用植物的开发利用价值性。对于功能基因而言，它们大多数以基因家族的形式存在，大多数同属一个家族的基因，尽管随着时空的变迁呈现出多样性分化，但其表达仍存在一定关联性，并与其他基因家族形成共表达网络。近年来，药用植物的功能基因组学发展较快，结构基因与功能基因相互渗透，参与了植物生长、发育、进化等生物功能调控。目前枸杞功能基因组研究还面临着众多的挑战。枸杞基因组上大量基因功能尚未被注释，精细功能基因组研究尚未完全开展；多数已知功能基因研究还处于基因分离阶段，并且过度依赖于生物信息学预测，缺乏直接实验证据；对于功能基因组仍处于以宁夏枸杞为主的单一研究，还需要进行大规模的基因功能分析。因此，人们对药用植物基因组和功能基因的研究和认知依然十分有限，对其研究任重而道远。

三、枸杞代谢组学研究前景

代谢组学以代谢物为标志，被认为是最接近生物表型的组学。植物多种代谢物相互关联，形成一个错综复杂调控网络。目前基因组、转录组、蛋白组、表观组、表型组、微生物组、离子组和代谢组等不同水平的组学进行整合、相互验证、相互补充，有助于全面深入地研究植物代谢在合成、调控和进化过程中各种变异等。随着新一代测序技术的进步和基因组组装技术多元化，已开启了富含代谢物多样性的非模式植物的基因组时代，基于基因组学与代谢学，快速解析基因功能和注释代谢物，进而挖掘出植物中天然化合物。此外，植物代谢物是植物生长和发育所必需的，每个物种都有自己独特的新陈代谢网络来产生特定的代谢物，这些植物代谢物有助于研究特定物种特有的活性代谢物的积累，可作为区分不同植物和食物品种的生物标志物。

在未来，代谢组学能够多层次辅助功能基因组学已成为基因组学研究的重要发展方向之一。如利用一些重要枸杞遗传资源与代谢产物相关的位点，发现用于检测与生物合成途径相关的多基因区域和基因；代谢组与功能基因组学相结合挖掘天然变体，还可以用来预测和注释其他代谢物和基因。随着枸杞生态进化研究不断清晰，枸杞系统发育与代谢物多样性关联，再结合基因组学与代谢组学相，也可以更好地鉴定与特定代谢相关的基因和未知代谢中间体；将共表达分析、整合组学、基因组学和比较基因组学相结合的方式，为解决代谢组学鉴定一些未知质量特征的结构提供了一条有效途径。

思考练习题：

1。枸杞基因组学研究的重要性是什么？

2。枸杞叶绿体基因组研究的主要内容和成果是什么？

3。枸杞基因组研究的主要方法是什么？

4。功能基因组学是什么？它与遗传学的什么角度相关？

5。枸杞遗传定位研究中，遗传标记的开发有哪些方法？利用哪些标记进行分析？

6。枸杞果实代谢物相关基因功能研究中，有哪些代谢产物被检测到？

枸杞中哪些代谢物存在显著差异？

7。简述泛基因组的概念和应用，并说明其在植物育种和进化研究中的作用。

8。说明枸杞功能基因组学研究所面临的挑战，并阐述代谢组学在该领域中的应用前景。

9。介绍枸杞基因组组装的技术挑战和现状，并探讨组装出高质量的参考基因组在枸杞功能基因组学研究中的重要性。