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第二章 枸杞功效及功能产品研究（第1页）

宁夏回族自治区联合中国科学院，组织全国相关领域优势力量，启动“十三五”重点研发计划重大专项——“枸杞功效的重大基础研究及功能产品研发”。

王志珍院士（中国科学院院士、中国科学院生物物理研究所研究员）团队结合国内外枸杞生物活性研究的前沿和现状及国内现有研究基础，围绕枸杞功效的物质基础、作用的分子机制及质量控制标准开展研究，并根据基础研究成果进行高附加值功能产品研发。在物质基础方面，首次建立了枸杞化合物数据库管理平台和枸杞小分子成分智能分析平台；发现了一批新的功能性成分，建立了以枸杞单糖组成图谱用来区分不同产地枸杞及进行枸杞多糖质量控制的方法；解析了精确枸杞基因组及枸杞长链非编码RNA特征。在功效机制方面，首次全面解析了枸杞子久服“坚筋骨、轻身不老”及“保肝明目”传统功效的分子机制。在国际标准方面，首次主导制定了《中医药-枸杞子》国际标准，掌握了国际标准话语权，助推枸杞产业健康发展。在功能产品研发方面，开发了枸杞稳糖颗粒和杞仙解郁颗粒制剂两种传统中药制剂，开发了15款枸杞功能产品，为枸杞生物医药开发开拓了新路径。

第一节枸杞生物活性的物质基础研究一、枸杞指纹图谱研究

枸杞是茄科枸杞属的落叶灌木。近代医学研究发现枸杞含有多种有效成分，包括枸杞多糖、甜菜碱、类胡萝卜素、黄酮、药用氨基酸等。其中，枸杞多糖具有增强免疫力、防衰老、抗肿瘤、抗氧化等多方面的药理作用。为了加快物种研究，获得精确的基因组信息是一种重要方法。基于基因组及转录组等组学数据揭示了枸杞进化及枸杞成药特性。

（一）宁夏枸杞基因组分析

对枸杞进行基因组的测序和预测评估后，发现枸杞具有高杂合、高重复的复杂基因组。因此，研究团队利用目前最先进的三代测序、二代测序、光学图谱测序、三维基因组测序等技术，精确解析了枸杞基因组。通过分析，发现枸杞基因组大小为2。03Gb，其中包含31646个基因。其中，编码区占总基因组的1。92%，非编码区占据98。8%。枸杞基因组的获得，为枸杞的分子育种、品种改良、功能研究及国际出口等提供科学依据。

（二）宁夏枸杞进化分析

在没有基因组之前，研究团队并不清楚枸杞在进化上的地位、分化时间及是否由于环境的动荡，发生了基因组大范围改变，有了枸杞基因组后能回答上述问题。研究团队对12个物种（金鱼草、矮牵牛、烟草、土豆、西红柿、枸杞、茄子、乌梅、番木瓜、拟南芥、葡萄、水稻）构建了系统发育树，树形结构支持被子植物APG系统，推算出枸杞与茄科共同经历了一次全基因组的三倍化事件，从而获得性状基因。

（三）宁夏枸杞比较基因组研究

对于药食同源的中国传统中药材，枸杞有哪些的特异特征存在，为了解析这个问题，研究团队将组装的枸杞基因组与其他茄科（茄子、土豆、西红柿、烟草）基因进行比较分析，枸杞得到2367个特异基因，对这部分基因进行功能元件的预测，整体基因分布等，结构功能进一步挖掘。

（四）宁夏枸杞主要药效成分功能基因研究利用生物信息学方法分析发现，枸杞果胶多糖合成相关基因，在枸杞进化过程中发生基因扩张，枸杞红素、花青素部分基因高表达，提示可能与枸杞的药用价值相关。基于基因组及表达数据，首次提出枸杞果胶多糖、枸杞红素、花青素的合成通路及关键基因。另外，对宁夏枸杞的非编码RNA进行研究发现，枸杞不同药效器官存在着特异的非编码RNA转录本。

二、枸杞成分系统分析

（一）枸杞小分子化合物的研究

1。宁杞1号果实和根皮化学成分的提取分离及鉴定从宁杞1号枸杞的果实和根皮（地骨皮）中分离得到各类成分共66个，包括枸杞色素类成分4个，酚酸类成分（包括黄酮、木脂素等）45个，生物碱类成分17个，其中枸杞特征性成分枸杞精胺类化合物10个，指标性成分甜菜碱和葫芦巴碱以及枸杞红色素类成分均分离得到，较完整地揭示了宁杞1号小分子的主要特征性及成分。

2。宁杞1号果实及根皮中小分子化学成分分析通过建立一套完整的宁夏枸杞样品采集方法优化，LC-MS信息采集—数据分析方法建立—快速分析的流程，使用UNIFI数据管理平台建立了包含366个枸杞小分子化合物的多级高分辨质谱理论数据库；同时将分离纯化得到的66个化合物进行UPLC-QtofHDMSMS数据采集，已经构建了基于高分辨质谱大数据的枸杞小分子数据库，以及基于该数据库和分子网络技术的枸杞小分子成分智能分析平台。

应用枸杞小分子数据库，对宁杞1号以及地骨皮中的小分子化合物进行了快速识别与分析，共筛查到化合物114个，其中，正模式106个、负模式14个（有共同筛出）。化合物类型分类包括亚精胺类15个、酰胺类29个、环肽类3个、生物碱类11个、黄酮及黄酮苷19个、有机酸及其酯类29个、香豆素类4个、木脂素类7个。其中，从宁杞1号果实中筛查出化合物71个、地骨皮中筛查到61个。果实与地骨皮所含化合物类型基本一致。

（二）枸杞糖类化合物的研究

1。宁夏枸杞多糖类成分及活性研究从干燥的枸杞子中提取分离得到10个均一多糖。活性筛选结果显示，枸杞均一多糖LBP1A1-1、LBP1C-2和LBP0。1-S有明显地抑制Aβ42生成与聚集的活性，硫酸化枸杞多糖Sul-LBP1B-S-2在体外具有较好地抑制HMEC-1管腔形成的活性。此外，枸杞均一多糖LBP0。05-1和LBP0。1-S具有显著的抗肝纤维化活性，体外可明显逆转由于TGF-β诱导导致的纤维化标志蛋白α-SMA的表达上调。

2。枸杞多糖质量控制研究

多糖作为枸杞的重要活性成分，大量研究已表明，枸杞中最具有利用价值的是枸杞多糖。而目前枸杞多糖的质量控制方法，缺乏系统性及统一的标准。本研究以18批次6个产地的枸杞多糖为研究对象，建立了基于PMP衍生化结合HPLC法的多糖单糖组成指纹图谱以及基于Need’s甲基化法结合GC-MS法的多糖单糖残基连接方式指纹图谱，后又对两种方法的重现性、样品稳定性和仪器精密度进行了考察，结果显示该两种方法可以作为质量评价标准。此外，氧化降解结合LC-MS分析的寡糖片段指纹图谱，部分酸水解、酶解后结合HPLC法的寡糖片段指纹图谱方法的建立也取得了一定进展。以上研究结果表明，以多种方法联用建立的指纹图谱所形成的质量控制体系，可更全面地反映不同枸杞产品所含多糖成分的种类与含量，在质量评价以及监控产品批间差异上具有实用价值。

第二节枸杞传统功效的分子机制研究一、解读“坚筋”“轻身”功效的科学内涵骨骼肌是哺乳动物体内最大的组织器官，占体重40%~50%。除了基本的支撑和运动功能外，骨骼肌也是维持正常机体能量平衡的重要器官。骨骼肌的运动功能和能量代谢的改变与多种疾病密切相关，例如肌肉退行性疾病、糖尿病、肥胖症等。研究团队以小鼠为模型，通过灌胃的给药方式，检测了枸杞提取物对骨骼肌成分和能量代谢的影响。发现枸杞提取物能显著增加小鼠胫骨前肌和腓肠肌的肌肉体重比，减少白色脂肪含量，提高小鼠的平均最大跑步距离，也就是增加了小鼠肌肉的耐力。体内小鼠实验和体外细胞实验表明，枸杞水提物通过增加肌肉中氧化型肌纤维比例增强有氧呼吸作用来实现这一功能。进一步对作用机制研究发现，枸杞水提物通过激活雌激素相关受体ERRγ（estrogen-relatedreceptorgamma）上调IIa型氧化型肌纤维的比例和调节骨骼肌能量代谢，并且PKA-CREB信号通路介导了ERRγ的激活。

这是首次证明枸杞水提物可以调节骨骼肌重塑和能量代谢，为枸杞“坚筋”的传统功效提供了科学解读。“轻身”代表抗疲劳作用。在研究团队的实验模型中，不仅发现枸杞提取物能显著增加小鼠肌肉的耐力；而且同时发现枸杞提取物喂食的小鼠血清中乳酸水平也显著降低，说明枸杞提取物缓解了肌肉疲劳。

研究发现，枸杞提取物在增强肌肉耐力、增加氧化型肌纤维比例、增加肌肉体重比、减少脂肪含量、增加能量产生和能量交换、促进线粒体生物合成、促进脂肪酸氧化和产热方面均起到“模拟锻炼”的效果，为枸杞转化应用提供了科学依据。枸杞作为一种药食两用物，其“锻炼模拟剂”的作用可能被广泛应用于多个方面。例如，对于长跑或其他耐力型运动员，枸杞可能有助于提高肌肉中负责耐力的氧化型肌纤维的比例；对于缺乏或不能进行适当体育锻炼的人群，枸杞可能有助于增加肌肉重量，提高肌肉能量代谢，强身健体；对于衰老人群，枸杞可以帮助避免肌肉流失和功能衰退。枸杞的上述功能还有待于进一步在相应模型中实验验证。综上所述，枸杞这一重要功效机制的新发现，在基础研究方面科学阐述了中药传统功效的内涵，在应用转化方面可望对枸杞产业高质量发展起到重要的推动作用。

二、解读“骨”功效的科学内涵

骨质疏松症是一种多病因引起的，以骨量减少，骨组织显微结构退化，骨强度降低和骨脆性增加为特征的骨退行性代谢性疾病。衰老性骨质疏松是男、女性伴随年龄增长均有的骨丢失现象，其并发症骨折的致残致死率极高，骨质疏松症患者骨折的发生风险高达40%。目前市场上治疗衰老性骨质疏松症的化学药物虽具一定的疗效，但这些药物常常受其自身固有的毒性及选择性的制约，系统及局部的各种不良反应几乎不可免。与之相比，枸杞子作为经典的药食同源中药，具有“坚筋骨”的功效，开发潜能巨大。

PKA-CREB-ERRγ通路增加氧化型肌纤维比例、有氧呼吸和肌肉耐力“模拟锻炼”功效的分子机制研发团队以最接近衰老性骨质疏松症的动物模型，即自然衰老致骨质疏松的小鼠为模型，通过研究首次发现枸杞水提取物（LBE）、枸杞多糖（LBP）和主要单体多糖类成分（均一多糖LBP1C-2）可以显著增加骨密度、增加骨强度；进一步通过间充质干细胞模型发现以上三类成分可显著促进成骨细胞分化和矿化，证明了枸杞子及其主要单体成分是通过促进骨形成而发挥“坚骨”功效的，并确定了作用机制和作用靶点。研究团队深入解析了枸杞子“坚骨”功效的科学内涵，对衰老性骨质疏松症的预防和治疗具有现实意义。

三、解读“不老”功效的科学内涵（一）枸杞子水提取物抗衰老的作用机制研究团队发现，含有22。03%多糖和小分子抗氧化剂的枸杞子水提物（LBE）可显著延长秀丽隐杆线虫的寿命，且对线虫的繁殖和咽泵无明显影响。与平均寿命较长的线虫相比，平均寿命较短的线虫的寿命延长效应更显著。此外，LBE延长寿命的作用依赖于去乙酰化酶sir-2。1。值得注意的是，LBE可稳定地延长伴有热休克转录因子-1（hsf-1）缺陷野生型线虫的平均寿命，而且这一作用也依赖于sir-2。1。此外，LBE延长了伴有hsf-1缺陷的神经退行性线虫的寿命，并减轻了毒性蛋白聚集。研究表明，LBE可能是一种潜在的抗衰老天然膳食补充剂，特别是对寿命短的个体，这可能是一种治疗以hsf-1缺乏为特征的神经退行性疾病的潜在药物。枸杞对生理状态较差、寿命较短的个体表现出更显著的延缓衰老作用。

研究团队对LBE处理线虫的浓度对应成人每日服用剂量进行了测算。以抗衰老明星分子二甲双胍为例，8。25mgml（50mmolL）二甲双胍是处理线虫的常用有效浓度，而美国FDA批准的二甲双胍抗衰老临床试验（TAME）的用药浓度为成人每日2g。对应5mgmlLBE处理线虫相当于成人每日口服1。2gLBE，根据LBE制备得率25%，则相当于成人每日口服枸杞子约5g。考虑到日常食用枸杞子的萃取效率和人体消化吸收效率，这一剂量与《中华人民共和国药典》（2015版）推荐的枸杞子用法与用量（6~12g）是十分吻合的。团队的研究为枸杞子保健和治疗的用量参考标准和相关枸杞功能产品的研发提供了科学依据和指导。

（二）枸杞叶黄酮提取物抗衰老的作用机制枸杞叶俗称天精草。研究发现，其中黄酮类化合物的含量高于果实，是一种廉价而丰富的黄酮提取原料。黄酮类物质作为天然抗氧化剂的代表，具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗衰老等作用。长期以来，枸杞叶多用作廉价配料，未能充分发挥其潜在价值。国内外对银杏黄酮抗氧化和衰老的研究较多，但对枸杞叶黄酮类化合物相关研究较少。研究团队与宁夏大学合作开展了枸杞叶黄酮提取物（LBLF）对线虫寿命的研究。多次重复实验显示，200μgmlLBLF能显著延长线虫平均寿命约15%，即从（14。9±1。0）d延长至（17。1±0。4）d。进一步实验还表明LBLF能增强衰老线虫的运动能力。

对LBLF处理线虫的浓度对应成人每日服用剂量进行了测算。以二甲双胍为标准，对应200mgmlLBLF处理线虫相当于成人每日口服0。05gLBLF，根据LBLF制备得率3%，则相当于成人每日口服枸杞叶约1。6g（干重）。考虑到日常食用枸杞叶的萃取效率和人体消化吸收效率，这一剂量与日常习惯用量（1~3g）是十分吻合的。团队的研究为枸杞叶保健和治疗的用量参考标准和相关枸杞功能产品的研发提供了科学指导。

（三）枸杞叶黄酮提取物对内皮细胞氧化损伤的保护作用血管内皮细胞结构和功能的改变是多种心血管疾病的共同病理基础，内皮细胞损伤后通过增加血管通透性，激活凝血系统和血小板等，造成一系列病理变化。越来越多的证据表明多种因素（衰老、糖尿病、高血压、吸烟等）都会引起内皮细胞氧化损伤。研究枸杞对内皮细胞氧化损伤的保护作用对防治心血管疾病意义重大。团队使用过氧化氢（H2O2）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）氧化应激模型，发现LBLF能有效降低HUVECs的活性氧和脂质氧化水平，并能显著增强HUVECs多种抗氧化酶活力〔如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px等〕。基于转录组测序技术（RNA-Seq）分析LBLF对H2O2诱导的HUVECs基因表达及信号通路的影响机制，发现H2O2氧化应激条件下LBLF对HUVECs的保护作用机制，可能是通过上调丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路下游的EPO和HO-1基因表达来实现。从分子机理上揭示了枸杞叶黄酮提取物对内皮细胞氧化损伤具有保护作用。

（四）从干细胞角度解读枸杞提取物的“不老”功效衰老是由构成人体的所有器官系统性功能衰退造成的。随着年龄的增加都会伴随肌肉流失，研究发现，30岁后每十年肌肉流失3%~8%，60岁以后更加严重。人体的绝大多数器官都具有一定的自我更新能力，新形成的细胞可以取代损坏或异常细胞。大多数器官中均存在着一类特殊的细胞，它们能源源不断地产生新的多功能细胞补充和修复受损器官，这种特殊的细胞就是干细胞。衰老通常与干细胞功能降低有关，而干细胞功能对于再生很重要。骨骼肌中的肌肉干细胞具有制造新肌肉组织的强大能力，而且还可以不断分裂产生更多的干细胞，这一过程称为“自我更新”。但是它们的相关能力会随着年龄的增长而减弱，从而导致肌肉创伤后的再生能力下降。

研究团队以小鼠为模型，通过灌胃的给药方式，首先发现枸杞提取物可以增加骨骼肌中干细胞的数量。然后通过骨骼肌损伤再生模型以及体外分离培养肌纤维的方式，证明枸杞提取物可以通过提高骨骼肌干细胞的活化和自我更新能力促进骨骼肌损伤再生过程。并进一步在衰老小鼠中，证明了枸杞提取物能延缓随着衰老进程干细胞数量的减少，从而减少肌肉萎缩进程，维持肌肉功能。与年龄相关的肌肉功能受损严重影响老年人口的健康状况。随着人口的迅速老龄化，诸如肌肉退化之类的问题正在成为日益严峻的社会挑战。所以，这一发现不仅从干细胞功能维持的角度为枸杞“抗衰老”的传统功效提供了科学解读，同时也为枸杞在抗衰老市场的应用提供了理论依据。而且干细胞是目前生命科学最前沿、最尖端的科学之一。对干细胞的深入研究，可能将从深层次上揭示衰老的成因，最终实现人类延缓衰老的梦想。

四、解读“保肝明目”功效的科学内涵（一）枸杞多糖（LBP）对常见肝损伤的保护机制研发团队通过细胞模型和动物模型确定了枸杞红素单体对于酒精性肝病的保护作用和分子机制。通过生物物理的方法找到了单体结合的分子靶点。此外在“瘦人型”非酒精性脂肪肝动物模型中研究了枸杞多糖的保护机制，发现其主要通过NF-κB和NLRP3炎症小体起作用。在肝性脑病模型上研究了枸杞多糖的保护作用，发现促炎症细胞因子TNF-α和IL-6是疾病状态下联系肝脏和脑部眼部损伤的信号分子。

枸杞多糖（LBP）是枸杞的主要生物活性成分，具有增强肝脏抗氧化、抑制炎症反应、清除自由基等抗氧化功能。LBP已被证明在多种肝脏疾病模型中具有肝脏保护作用，包括急性肝损伤、非酒精性脂肪肝、药物诱导性脂肪肝和肝癌。

酒精性肝病是指由酒精滥用引起的肝损伤，范围从脂肪变性、酒精性脂肪肝疾病和酒精性肝炎到酒精性肝硬化。人们普遍认为，女性更容易受到酒精介导的肝病的影响，同时临床现象表明性激素与酒精性肝病的发病密切相关。在小鼠的慢性酒精性肝病模型中，研究发现与雄性小鼠相比，乙醇对雌性小鼠造成更为严重的肝损伤，并且LBP对酒精性肝病诱发的雌性小鼠肝损伤具有更为显著的缓解作用。